Karcynogenezę bada się za pomocą różnych standaryzowanych testów toksykologicznych. Pierwsza część tych testów przeprowadzana jest in vitro, a jeśli są pozytywne - przeprowadzamy eksperyment in vivo. To eksperymentalne podejście krok po kroku nazywa się PODEJŚCIEM PUNKTOWYM DECYZJI, sekwencją prób, które kończą się na końcu każdej próby, aby zdecydować, jak postępować z próbą. Jest pięć etapów:
FAZA A: budowa i charakterystyka związku rakotwórczego;
PHASEB: w tej fazie krótkoterminowych testów in vitro wykorzystuje się komórki ssaków. Najczęściej stosowanymi komórkami są hepatocyty, ponieważ badany jest stopień naprawy uszkodzeń, które rozwijają hepatocyty, zgodnie z nasileniem uszkodzeń spowodowanych przez substancję. Krótko mówiąc, nie określamy samych uszkodzeń, ale to, jaka część systemu naprawczego została aktywowana przez komórkę wątroby.
Wdrożona procedura polega na wytworzeniu 3 hodowli hepatocytów. W pierwszej hodowli hepatocyty są zdrowe, w drugiej poddaje się je działaniu badanej substancji, a na końcu w trzeciej substancji kontrolnej, która jest z pewnością rakotwórcza.Te trzy kultury zawierają radioaktywną zasadę pirymidynową, która jest trytowaną tymidyną, która działa jako marker.
Jeśli badany związek powoduje mutację w DNA, komórka reaguje na ten problem, aktywując systemy naprawcze. Kawałek DNA, który uległ mutacji jest wycinany i dzięki działaniu DNApolimerazy brakujący fragment zostaje zastąpiony nowym.Do korekcji DNApolimeraza wykorzystuje nowe zasady, w tym trytowaną tymidynę.Wprowadzana jest radioaktywna zasada. Analiza radioaktywności określa poziom mutacji w leczonych komórkach: im wyższa radioaktywność, tym większe mutacje DNA.
Również w fazie B przeprowadzane są testy na bakteriach, aby móc zbadać, czy występują jakiekolwiek mutacje odwrotne. Wykorzystywane bakterie to salmonelle już będące nosicielami mutacji. Mutacja dotyczy syntezy histydyny, więc salmonelle nie są w stanie rosnąć bez histydyny. Te kolonie bakteryjne traktuje się częściowo badaną substancją, częściowo jako kontrolę ujemną, a częściowo jako kontrolę pozytywną, a następnie bada się znanym czynnikiem rakotwórczym. Jeżeli ta substancja badana jest pośrednią genotoksyczną, do pożywki hodowlanej należy wprowadzić enzymy metabolizujące. W tym momencie są 3 kultury, które zostaną wysiane i wyhodowane na szalkach Petriego (w pożywce hodowlanej nie ma histydyny).Jeśli nie ma żadnych mutacji badanego czynnika rakotwórczego, teoretycznie nie powinno być żadnej na płytkach Jeśli wystąpiło mutagenne działanie czynnika rakotwórczego, mogło to zmienić pierwszą mutację i stworzyć drugą mutację zdolną do wzrostu bakterii na pożywce hodowlanej wolnej od histydyny.W tym przypadku druga mutacja, która modyfikuje pierwszą mutację i przyjmuje nazwę RETROMUTACJE Wreszcie, jeśli w piasta petri występuje znaczny wzrost, czynnik rakotwórczy jest bezpośredni.
Zawsze z testem in vitro możliwe jest określenie integralności chromosomów.Test ten jest zawsze przeprowadzany na komórkach ssaków i służy do badania substancji toksycznych zdolnych do wywoływania mutacji niektórych enzymów odpowiedzialnych za biosyntezę DNA. jest poddawana analizie in vitro Aby móc określić, czy badana substancja wpływa na integralność i liczbę obecnych chromosomów, stosuje się test mikrojądrowy. Mikrojądra to pęcherzyki, które tworzą się z częścią chromatyny wewnątrz.Chromatyna włączona do tych mikrojąder może być albo całymi chromosomami, albo fragmentami chromosomów.Mikrojądra powstają w wyniku nieprawidłowego podziału komórki, co powoduje powstanie komórek potomnych z nierównym materiałem genetycznym Wynikiem tego badania będzie określenie substancji, które są zdefiniowanymi truciznami klastogennymi i wrzecionowatymi. Substancja klastogenna wytwarza mikrojądra z acentrycznymi fragmentami chromosomów, więc substancja powoduje pęknięcie chromosomów, zamiast trucizny wrzeciona wytwarza mikrojądra, które w nim są obecne, całe chromosomy.
Jeżeli badana substancja wywołuje genotoksyczność w jednym lub kilku badaniach, jest to określane jako wysoce podejrzane, a więc przechodzi bezpośrednio do fazy D. Jeżeli natomiast badana substancja nie wywołuje żadnego działania genotoksycznego, przechodzi do fazy badania C bo może być promotorem.
FASEC: w tej fazie można przeprowadzić zarówno testy in vitro, jak i in vivo.
W testach in vitro można było wykazać, że substancja promotorowa może przerwać połączenia szczelinowe między komórkami normalnymi a komórkami nowotworowymi, z wynikającym z tego przejściem substancji między tymi dwiema komórkami.
Test in vivo to indukcja guzów skóry u myszy. Testowaną substancję nakłada się dwa lub trzy razy w tygodniu na skórę myszy. W ciągu 2/3 miesięcy, jeśli ta substancja jest promotorem, mogą pojawić się formacje brodawczaka. U myszy brane są pod uwagę dwa główne dane: liczba myszy dotkniętych brodawczakami i liczba brodawczaków obecnych na każdym zwierzęciu. Jeżeli substancja działa jako promotor i u leczonej myszy rozwinie się guz, oznacza to, że rzeczywiście jest to substancja o działaniu promotora.
Po zakończeniu tych testów przechodzimy do długoterminowych testów in vivo.
FASED: w tej fazie testowane są wszystkie związki, które wykazują działanie mutagenne oraz wszystkie związki, które nie wykazują działania mutagennego. Testy, które można wykonać, są różne, niektóre z nich to testy wykonywane na wątrobie, płucach i wreszcie na piersiach.
Test wątrobowy wykazuje powstawanie nie nowo powstałego guza, ale ogniska nowotworowego, a więc czegoś, co przygotowuje się do przekształcenia się w guz. Komórki tego ogniska są już komórkami nietypowymi, dlatego przeszły mutację i przygotowują się do przekształcenia się w komórki nowotworowe. Po pewnym czasie, dzięki badaniu autopsyjnemu, określa się powstawanie ognisk przednowotworowych, obliczając liczbę i zasięg tych formacji przednowotworowych.
Badanie płuc pozwala na wykrycie gruczolaka, który jest „anomalią komórek tkanki płucnej. Również w tym przypadku tkanka płucna szczura jest badana po dość długim czasie (miesiącach) (gruczolaki te są łatwe do zidentyfikowania, ponieważ są białawymi guzkami na nabłonku płuc).
Badanie piersi pozwala na określenie guzów w tkance gruczołowej. Zawsze oceniana jest liczba utworzonych gruczolaków oraz liczba zwierząt z gruczolakami.
Jeśli wyniki tych testów są pozytywne, substancja badana jest rzeczywiście czynnikiem rakotwórczym. W tym momencie przechodzimy do prowadzenia kosztownych testów z bardzo długimi czasami wykonania.
FAZA: w tej fazie zmienna liczba zwierząt, od 20 do 50, poddawana jest długotrwałym testom, które są bardzo drogie i uzyskanie określonych wyników zajmuje dużo czasu; mówimy o około 1/8 życia zwierzęcia.Niewykluczone, że w trakcie tych badań niektóre zwierzęta umierają, ale zawsze są one badane z autopsją i badaniem typu histologicznego. Wybrane zwierzęta to zawsze szczury i myszy, a tylko 70-80% przeżywa do końca testów długoterminowych. Wykorzystywane zwierzęta są właśnie odstawiane od piersi, ponieważ im są młodsze, tym są bardziej wrażliwe na leczenie. Podczas długoterminowego okresu testowego naukowiec jest zawsze wspierany przez matematyka-statystyka, który jest w stanie uwzględnić wszystkie zebrane informacje i odtworzyć różne dane.
Dawki testowane na zwierzętach rozpoczynają się od maksymalnej tolerowanej dawki i wszystkich jej podwielokrotności i ocenia się reakcję dawka-odpowiedź u zwierzęcia.
Podawanie musi zawsze zbliżać się do drogi, przez którą człowiek może wejść w kontakt z badaną substancją, a więc drogą doustną, skórną lub oddechową, natomiast w przypadku badania rakotwórczości leku przydatne jest również podanie dożylne.
Badane grupy zwierząt to 4 (50 zwierząt w każdej grupie):
- Grupa NAIF, która nie ma leczenia;
- Grupa leczona pojazdem;
- Grupa leczona badaną substancją;
- Grupa leczona znanym czynnikiem rakotwórczym.
Bardzo ważne jest, aby liczba zwierząt w każdej grupie była jak najbardziej równa.W rzeczywistości, jeśli różnica w liczbie zwierząt jest zbyt duża, test statystyczny może okazać się fałszywy.
Przeprowadzane oceny to:
- Całkowita częstotliwość nowotworów;
- Częstotliwość niektórych nowotworów;
- Częstotliwość zwierząt z więcej niż jednym typem nowotworu;
- Liczba nowotworów zwierzęcych.
Na końcu wszystkich tych faz badań substancja jest klasyfikowana w rankingu ustanowionym przez IARC (Międzynarodową Agencję Badań i Rozwoju Raka) oraz Agencję Ochrony Środowiska (EPA).
Inne artykuły na temat „Badanie i ocena karcynogenezy”
- Karcynogeneza
- Toksyczność i toksykologia
- Toksykologia cyklu rozrodczego i teratogeneza
